Práctica 4 / sesión 3 Preparación de medios de cultivo.

       PRÁCTICA 4 SESIÓN 3 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 

 

OBJETIVOS

El objetivo de la presente práctica es aprender a preparar correctamente los principales medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio de microbiología.

FUNDAMENTOS

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales  y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer. 

MATERIALES Y REACTIVOS

El agar que se quiera preparar, Erlenmeyer o botella para realizar la mezcla, agua destilada, varilla, microondas, embudo, placas Petri o tubos, mechero.

PROCEDIMIENTO

En primer lugar cogemos el agar que queramos preparar, hay una gran variedad de agares que se pueden utilizar, ya que cada uno de ellos tiene su función característica a la hora de cultivar los microorganismos. 

Los medios de cultivo pues, se pueden utilizar para distintos fines, como por ejemplo:

• Separación y aislamiento de microorganismos presentes en una muestra.
•  Paso previo para la identificación de un microorganismo problema. Se pueden obtener cultivos puros (axénicos) a partir de colonias aisladas.
• Conocer el tipo de metabolismo en función de los nutrientes que utiliza o los metabolitos que produce.
• Estudios macroscópicos, es decir, de las características de las colonias en medio sólido.
• Realización de antibiogramas.
• Pruebas de concentración mínima inhibitoria (CMI)
• Conservación de especies.

Los agares que utilizamos para el cultivo de los microorganismos están formados de una serie de componentes en común. 

1. Nutrientes energéticos: 

• Fuente de carbono: puede aparecer como sustancias muy sencillas (ácido acético, alcohol, citrato sódico…), de monosacáridos y disacáridos (glucosa, lactosa…) o en forma más compleja (almidón). El uso de unas moléculas u otras es muy útil para su identificación bioquímica y clasificación taxonómica.
• Fuente de nitrógeno: es menos energética pero necesaria. La proporcionan las proteínas, péptidos o aminoácidos. Suele incluirse en forma de gelatina, extractos de carne, peptonas...

2. Nutrientes no energéticos: 

• Agua: indispensable, ha de ser destilada para no alterar el equilibrio de sales. En los medios con agar recién preparados, la evaporación o tiempo de almacenamiento excesivo puede reducir la actividad del agua de la superficie, produciendo colonias más pequeñas o inhibiendo el crecimiento.
• Sales minerales: proporcionan equilibrio osmótico para evitar la lisis o deshidratación de los microorganismos, y aportan micronutrientes. Se añaden sales de sodio, potasio, magnesio, hierro…
• Fuente de azufre: generalmente en forma de sulfatos, tiosulfatos y aminoácidos azufrados como la metionina.
• Fuente de fósforo: en forma de fosfatos.
• Otros componentes:
• Agentes solidificantes: en los medios sólidos y semisólidos. El agar, un polisacárido obtenido de algas rojas, es el más usado. La gelatina y la albúmina apenas se usan pues son consumidos por la mayoría de los microorganismos.
• Tampones: para estabilizar el pH
• Indicadores de pH: según el pH del medio tienen un color u otro (rojo neutro, azul de bromotimol, fenolftaleína…)
• Agentes reductores: para promover la anaerobiosis en el medio, se usa tioglicolato sódico, ácido ascórbico, cisteína…
• Factores de crecimiento: para ciertas especies se necesitan ciertos compuestos especiales, como vitaminas, purinas o pirimidinas.
• Factores inhibidores: impiden el crecimiento de algún tipo de microorganismos. Existen muchos sustratos de este tipo:
• Inhibidores de Gram(-): azida sódica
• Inhibidores de Gram(+): eosina-azul de metileno, cristal violeta, verde brillante
• Inhibidores de microorganismos no entéricos: sales biliares
• Antibióticos.
• A la hora de preparar medios de cultivo, tenemos que tener en cuenta los distintos tipos de cultivos que hay:
• Según su consistencia
• Líquidos (caldos): no contienen agar, se preparan en tubos. Favorecen el desarrollo y multiplicación de las bacterias por la fácil difusión de los nutrientes.
• Sólidos: contienen agar en una proporción de 15-17 g/l. También pueden tener gelatina o albúmina. Se preparan en tubo inclinado o placa. El crecimiento es más difícil, son muy buenos para aislamiento, morfología de colonias, producción de hemólisis…
• Semisólidos: con agar entre 3-5 g/l, suelen ir en tubo. Para movilidad de microorganismos.
• Según su composición
• Definidos: su composición química es totalmente conocida.
• Complejos: compuestos por mezclas de extractos de materiales naturales cuya composición química exacta no es conocida.
• Según su utilidad
• Medios generales o comunes: apropiados para el crecimiento de la mayoría de microorganismos poco exigentes. Ejemplos: caldo nutritivo, PCA...
• Medios enriquecidos: se les añade ciertos productos para favorecer a microorganismos más exigentes (sangre, suero, glucosa). Ejemplos: agar lactosado, agar sangre...
• Medios selectivos: llevan sustancias enriquecedoras e inhibidoras que permiten el desarrollo de algún tipo microbiano. Por ejemplo, el agar bilis verde brillante.
• Medios diferenciales: incluyen algún componente que da información adicional por medio de reacciones bioquímicas (azúcares, indicadores de pH, colorantes).
• Muchos de los medios son tanto selectivos como diferenciales, como el agar MacConkey o el agar Levine, selectivos para Gram- y diferencial entre fermentadores de lactosa y no fermentadores.
• Medios de transporte y conservación: para asegurar la viabilidad de los microbios desde la toma de muestras hasta la siembra en laboratorio. Son medios no nutritivos que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas y evitan los efectos letales de la oxidación. Los más usados son el Stuart, Amies y Cary-Blair.

Ya una vez tengamos claros todos los conceptos anteriores, podemos proceder a realizar nuestro medio de cultivo.
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se comercializan ya preparados y esterilizados. Sin embargo, existe la posibilidad de comprarlos liofilizados.
Asique primero vamos a disolver los componentes del medio en agua destilada. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, añadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullición del mismo en el microondas agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios líquidos no es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la completa disolución de la misma.
Luego se esteriliza la disolución, para evitar el crecimiento de contaminantes.
Según el recipiente donde vayamos a echar nuestro medio de cultivo, serán diferentes los procesos.
 

Medios sólidos en placa: Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar al autoclave (121⁰C) durante 15-20 minutos. Una vez estéril, esperar a que enfríe pero sin que llegue a solidificar, después, repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que solidifique en posición invertida.

Medios líquidos: Una vez disueltos los componentes, repartir en tubos a razón de unos 2-4 ml por tubo en caso de medios líquidos y unos 6-8 ml cuando sean tubos de agar inclinado, tapar con tapón de aluminio y llevar a esterilizar. En este último caso, tras la esterilización, se dejarán apoyados en una superficie inclinada hasta que solidifiquen en forma de slant o punta de flauta.

CÁLCULO Y RESULTADOS

El único cálculo que tenemos que realizar en esta práctica, es básicamente realizar una regla de tres para poder saber qué cantidad de agar o de caldo le corresponde a los mililitros que nos estén pidiendo.