Practica 7 / Sesion 4 - Tinción de Gram

Tinción de Gram

 

 

Objetivos

Realizar la tinción de Gram de una muestra de agua concreta

Fundamento

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína).
Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Materiales

Cubeta de cristal, Puente de tinción, Mechero bunsen, Vaso de precipitado, Pipeta Pasteur, Asa de siembra, Portaobjetos, Agua destilada, Papel secante.

Reactivos

Lugol, Acetona (30% acetona y 70% Etanol), Safranina, Cristal violeta.

Procedimiento

 Comenzamos preparando nuestra mesa con todos los materiales necesarios para realizar la tinción de Gram. En primer lugar encenderemos nuestro mechero para mantener unas buenas condiciones de esterilidad durante el proceso. Cogeremos el portaobjetos y nuestra muestra, si la muestra fuera solida comenzaremos echando en el portaobjetos una gota de solución salina y con el asa esterilizada cogeremos muestra de la placa o del tubo que nos corresponda. En caso de que fuera una muestra liquida, se esteriliza el asa de siembra y se coge directamente del tubo de muestra una pequeña cantidad que se coloca directamente en el portaobjetos. En nuestro caso utilizaremos una muestra sólida.

Una vez tengamos puesta nuestra muestra en el portaobjetos, lo dejaremos secar colocándolo a una altura no muy cercana a la llama dándole suaves pasadas, una vez completamente seco, pasaremos la muestra unos dos 2 seg. 4 o 5 veces por la llama para fijar la muestra y finalmente procederemos a la tinción.

En primer lugar cogeremos una cubeta y un puente para colocar el portaobjetos, allí comenzaremos utilizando el primer colorante, que es el cristal violeta, que sirve para teñir a las Gram(+). Cubriremos la muestra completamente y lo dejaremos 1 min. Después aclararemos con agua del grifo y una pipeta Pasteur. A continuación procederemos a echar el lugol que es un mordiente que se utiliza para fijar la coloración. Lo dejaremos 1 min. Y aclararemos con agua del grifo y una pipeta Pasteur. Ahora pasaremos a usar el alcohol acetona pero únicamente se dejara 40 seg. Ya que elimina rápidamente la tinción, aclaramos. Y por último utilizamos la safranina, que sirve para teñir la bacterias Gram(-), lo dejamos 1 min. y se aclara.

Se deja secar, y una vez esté completamente seco, se puede mirar en el microscopio.

Resultados

Presencia de Bacilos Gram- en la muestra.